Биологи из России, США, Чехии, Израиля и Испании впервые смогли измерить взаимодействие многих мутаций в одной белковой молекуле – для этого они изучили десятки тысяч мутантов зеленого флуоресцентного белка из медузы Aequorea victoria. Результаты, опубликованные в журнале Nature, проясняют механизмы белковой эволюции и позволяют глубже понять, почему эффекты мутаций зависят от генетического контекста, в котором они произошли.
Взаимодействие между разными событиями может привести к последствиям, сильно превышающим эффект каждого события. Например, немного протекающий бензобак в вашей машине или слабый ток на ее корпусе по отдельности не являются критичными поломками: они вполне позволят вам доехать до ближайшей мастерской, чтобы отремонтировать автомобиль. В случае же, если эти поломки встречаются одновременно в одном автомобиле, то их совместное действие может быть фатальным.
«Нас интересовал вопрос, как накапливающиеся в белке мутации взаимодействуют между собой, и как часто это может происходить в белковой эволюции», — говорит Карен Саркисян, сотрудник Института биоорганической химии РАН (ИБХ), первый автор статьи, — «Мы придумали способ одновременно измерить функциональность десятков тысяч мутантов одного белка и воспользовались им, чтобы определить, как влияние мутаций на яркость зеленого флуоресцентного белка зависят от присутствия в гене других мутаций».
Саркисян и его коллеги из МФТИ, МГУ, Нижегородской медицинской академии, Института белка, и других научных организаций России, Испании, США, Чехии и Израиля исследовали так называемый «ландшафт приспособленности» (fitness landscape). Эту метафору биологи используют, чтобы представить эволюцию организмов как прогулку по ландшафту, в котором каждой точке пространства соответствует определенный генотип, а ее высота определяется приспособленностью этого генотипа.
До недавнего времени, научные методы не позволяли получать достаточного количества экспериментальных данных, чтобы судить о структуре таких ландшафтов. В новой работе, благодаря оригинальному экспериментальному подходу, исследователям впервые удалось взглянуть на ландшафт приспособленности целого белка.
Для того чтобы измерить функциональность мутантов, ученые экспрессировали мутантные гены в бактерии Escherichia coli, а затем использовали клеточный сортер для сортировки клеток по восьми пробиркам, в зависимости от яркости их флуоресценции. Прочтение ДНК мутантных генов из каждой пробирки и последующий анализ данных позволили сопоставить яркость флуоресценции каждого мутанта с его генотипом.
а. Иллюстрация концепции ландшафта приспособленности зеленого флуоресцентного белка. Зеленая точка в центре — немутированный белок, точки на окружностях — мутантные варианты с одной, двумя и тремя отличающимися аминокислотами. Цвет отражает фенотип (индивидуальные свойства) мутанта: зеленый — мутант ярко светится, серый — мутант не светится. Стрелки отражают возможные маршруты движения по ландшафту приспособленности b. Визуализация всех полученных в работе данных на одной картинке. Последовательность зеленого флуоресцентного белка изображена в виде окружности: каждый маленький сектор обозначает одну аминокислотную позицию. Чем дальше круг находится от центра, тем больше мутаций содержит белок. Доля зеленого в каждом секторе отражает долю функциональных мутантов
«По сути, это первая экспериментальная иллюстрация концепции ландшафта приспособленности, которая была придумана 85 лет назад», — говорит Карен — «Измерив яркость пятидесяти тысяч мутантов, мы, наконец, смогли взглянуть на то, как на самом деле выглядит этот ландшафт для конкретного белка».
Ученые обнаружили, что только каждая четвертая аминокислотная замена оказывается нейтральна, большинство же мутаций негативно сказываются на функциональности белка. При этом, как и в примере с автомобилем, если одна слабовредная мутация в гене уже присутствует, негативный эффект последующих мутаций будет усугубляться, приводя к полной потери белком функциональности значительно раньше, чем при независимости эффектов мутаций друг от друга.
Исследователям также удалось прояснить вероятные биофизические механизмы взаимодействия мутаций: «Мы ожидали увидеть, что друг на друга будут влиять аминокислоты, расположенные близко в структуре белка. Вместо этого оказалось, что пары взаимодействующих мутаций распределены по структуре белка, на первый взгляд, довольно случайно. Мы смоделировали влияние мутаций на энергию сворачивания и выяснили, что, вероятно, когда суммарный груз всех накопившихся мутаций превышает определенный порог – в области 7-9 ккал/моль, — белок просто перестает сворачиваться и флуоресценция пропадает. Такой механизм «учета» мутаций может помогать эволюции эффективно отсеивать варианты генов со слабовредными мутациями», — заключает Дмитрий Болотин, сотрудник ИБХ, один из ключевых авторов статьи.
Сильный эффект взаимодействия мутаций, которые авторы нашли во флуоресцентном белке, может иметь важное значение для смежных областей науки. Одной из основных задач современной медицинской генетики является исследование заболеваний со сложной генетической компонентой, например, различных заболеваний сердечно-сосудистой системы.
Двадцать лет назад многие ожидали, что, прочитав последовательность ДНК, можно будет найти несколько конкретных изменений гена, которые бы объяснили основную долю таких болезней. На данный момент, очевидно, что такие болезни определяются большим количеством изменений в большом количестве генов. Вопрос взаимодействия этих изменений и воздействия на здоровье человека остается открытым. Новая работа на флуоресцентном белке дает основания генетикам начать поиск эффекта взаимодействий мутаций в сложных полигенных заболеваниях.
Экспериментальное изучение ландшафтов приспособленности различных белков может иметь и другой практический результат. С использованием искусственных нейронных сетей, тренированных лишь на части полученных данных, исследователям удалось достаточно точно предсказывать яркость флуоресценции мутантных белков, с которыми нейронная сеть в процессе обучения не сталкивалась.
Если предположить, что ландшафты других белков имеют схожее устройство, то в дальнейшем знания, полученные на примере этого белка, позволят оценивать функциональность мутантых форм других белков, используя лишь компьютерное предсказание, — добавляет Динара Усманова, выпускница МФТИ, автор работы.
Применение машинного обучения к данным по ландшафтам приспособленности может оказаться эффективным средством поиска удачных комбинаций мутаций и помочь в создании практически важных для биотехнологии и медицины белков.
