Ученые из МФТИ, Университета Стоуни-Брука (США), Лаборатории Колд Спринг Харбор (США) и Института биологии развития им. Кольцова РАН (часть работы проводилась на базе Курчатовского института) научились помечать делящиеся стволовые клетки тремя разными метками, — до этого можно было одновременно использовать максимум две метки. Новый способ повысит точность и скорость анализа деления стволовых клеток. В статье, опубликованной в Stem Cell Reports, ученые продемонстрировали, что с помощью тройной метки можно изучать размножение стволовых клеток в разных тканях.
«Реинкарнация» клеток
Во многих тканях и органах обнаружены стволовые клетки, которые обеспечивают восстановление тканей. Даже во взрослом мозге, вопреки расхожему заявлению, что нервные клетки не восстанавливаются, есть области, где происходит так называемый нейрогенез — развитие новых нейронов. Считается, что нейрогенез играет важную роль в обучении и памяти, реакции на стресс и регенерации поврежденной нервной ткани. Обычно регенерация тканей происходит следующим образом: стволовые клетки делятся, часть из них продолжает делиться, возобновляя запас стволовых клеток, а часть — дает начало новым взрослым клеткам. В разных тканях этот процесс протекает по-разному, задача ученых — выяснить, как именно он протекает и как на это могут повлиять разные факторы. Чтобы узнать, сколько делений проходят стволовые клетки в той или иной ткани, какова длина клеточного цикла, куда перемещаются новорожденные клетки и во что они превращаются, нужен способ за ними наблюдать.
Цикл клетки. Во время фазы G1 происходит подготовка к делению, содержимое клетки, кроме ДНК, удваивается. Во время фазы S с ДНК «снимается копия» — молекулярная машинерия строит дочернюю ДНК по образу и подобию ДНК клетки. G2 — конечный этап подготовки к делению, то есть к митозу (М). Во время фазы G1 клетка может сойти с цикла и перейти в фазу покоя G0, то есть перестать делиться. Иллюстрация пресс-службы МФТИ
Когда в делящейся клетке происходит удвоение ДНК, можно обмануть систему и подсунуть ей меченый «кирпичик» для дочерней ДНК. Для этого в организм вводят аналог тимидина, одного из четырех «кирпичиков», из которых состоит ДНК, и этот аналог встраивается в дочернюю ДНК вместо тимидина. Остальные «кирпичики» участвуют во многих других реакциях в клетке, поэтому для того, чтобы пометить только новосинтезированую ДНК, используют аналоги именно тимидина. В момент введения аналога тимидина помечаются только те клетки, которые находятся в S-фазе клеточного цикла, потому что именно во время этой фазы происходит удвоение ДНК. Причем когда помеченная клетка поделится и даст потомство, оно тоже будет помечено. Далее ученые могут взять ткань на анализ и обнаружить метки с помощью флюоресцентных антител.
Таким образом можно проследить за судьбой клеток, которые во время вкалывания метки были в S-фазе. В принципе, это можно сделать с помощью одной метки на нескольких группах мышей. Например, первую группу взять на анализ через 2 часа после ввода метки, вторую — через 24, третью — через 48 часов, а затем увидеть, где оказались меченые клетки и понять, как они перемещались. Однако в таком случае нужно слишком много мышей, да и точность страдает: мы следим за клетками не в одном организме. Если есть несколько разных меток, то можно ввести их в разные промежутки времени в одно животное. До настоящего момента ученым было доступно максимум двойное мечение. Но чтобы определить самые важные параметры с помощью двойной метки, все равно требуется много времени и несколько групп животных.
Метки, в качестве которых используются аналоги тимидина, распознаются с помощью антител. Но антитела не идеальны и могут связываться не только со «своей» мишенью, но и с похожей. Если одни и те же антитела садятся и на одну, и на другую метку, то их невозможно будет различить. Из-за того, что аналоги тимидина похожи и в большинстве случаев антитела их путают, до недавнего времени можно было использовать только две метки. Не так давно появился новый аналог тимидина, который можно выявлять не антителами, а с помощью так называемой клик-химии, когда присоединение флюоресцентного красителя происходит путем химической реакции. Проблема этого красителя была в том, что при тройном маркировании он оставлял «непрокрашенные» области, на которые садились антитела против двух других меток, в результате чего метки нельзя было различить. Однако ученые нашли способ закупорить эти области — с помощью родственного к красителю, но бесцветного вещества.
кишечник — голубым окрашена первая метка; зеленым — метка, введённая через 24 часа после первой; красным — через 24 часа после второй; белые клетки — это клетки в любой фазе цикла, кроме G0 (т. е. клетки, участвующие в делении). Фото автора исследования.
Ученые испробовали метод тройного мечения на стволовых клетках мозга, кишечника и семенников. Наиболее наглядный результат получился на кишечнике: метки, введенные в разное время, распределились в соответствии с известными данными о перемещении клеток в кишечнике. Кроме того, с помощью тройной метки получилось с высокой точностью определить новые важные параметры нейрогенеза. Таким образом, авторы статьи разработали инструмент для исследования стволовых клеток в любой ткани, который превосходит предыдущий по точности и ускоряет и облегчает получение результата.
Олег Подгорный, старший научный сотрудник лаборатории стволовых клеток мозга МФТИ и один из авторов статьи, комментирует: «Мы сейчас широко используем тройную метку в анализе нейрогенеза мышей при различных воздействиях: радиационном воздействии, диете, применении различных лекарств, в том числе и противоопухолевой терапии. Кроме того, мы применяем эту технологию для того, чтобы проверить, как влияют на нейрогенез те вещества, которые используются для лечения болезни Альцгеймера и других заболеваний нервной системы. При болезни Альцгеймера у человека снижаются когнитивные способности и память, и на сегодняшний день накопилось достаточно много данных, свидетельствующих о том, что нейрогенез очень важен для осуществления этих функций мозга».
