В биомедицинских исследованиях на клеточных линиях или в живых тканях часто используются природные белки, которые светятся при изменении концентрации важных для жизнедеятельности клетки веществ. Ученые из МФТИ и ФИЦ «Красноярский научный центр СО РАН» определили с высоким разрешением структуру одного из часто используемых в тест-системах светящихся белков. Сравнив конфигурацию белка до и после свечения, они сделали существенный шаг в понимании молекулярного механизма биолюминесцентной реакции. Результаты исследования важны для создания биолюминесцентных репортерных белков для применения в экспериментальной медицине, клеточной биологии и фармацевтической промышленности. Работа опубликована в журнале Scientific Reports.
Многие живые организмы светятся. Источник природного света — достаточно сложная биохимическая реакция, в которой специфический фермент люцифераза вызывает окисление небольшой органической молекулы люциферина. В природе обнаружены десятки видов, за свечение которых ответственны различные люциферины и люциферазы. В одном из широко распространенных видов морских организмов за биолюминесценцию отвечают кальций-регулируемые фотопротеины. Эти белки излучают свет в виде яркой вспышки при связывании с ионами кальция.
На практике фотопротеины уже достаточно давно применяются в медицинских и биотехнологических исследованиях. В частности, их активно используют фармкомпании при доклиническом тестировании лекарств, используя для этого клеточные линии, в которые встроен ген, кодирующий светящийся белок. В этом случае фотопротеины выступают в роли репортеров, которые светом информируют о появлении важного для жизнедеятельности клетки вещества или об активации каких-либо белков в ответ на добавление предполагаемого лекарства. В организме человека и животных кальций — один из ключевых ионов. Он регулирует функционирование практически всех клеток организма. Поэтому применимость фотопротеинов в качестве репортеров практически никак не ограничена.
Несмотря на схожесть фотопротеинов из разных видов, небольшие различия в структуре молекул и условиях протекания реакции приводят к тому, что у каждого организма отличаются оттенки, длительность и яркость свечения. Перед учеными стоит задача разобраться в сложных биолюминесцентных реакциях и создать высокочувствительные сенсоры с разной интенсивностью, длительностью и спектром свечения. Чтобы понять сложность этой работы, сравним ее с попыткой изучить двигатель внутреннего сгорания, не имея возможности остановить его, разобрать на детали и рассмотреть их. Мы можем просвечивать его в момент запуска, работы, остановки и фиксировать положения деталей, измерять его характеристики. Но воссоздать весь двигатель получится только по косвенным данным. Если учесть, что размеры молекул в миллионы раз меньше, а характеристики свечения зависят от положения отдельных атомов, становится понятна та сложность, с которой сталкиваются исследователи.
«Мы хотим под каждую конкретную задачу иметь нужный белок-инструмент. Для этого нам надо понимать детали молекулярного механизма работы разных биолюминесцентных белков. Наше исследование — это один из кирпичиков в общем понимании того, какие фотопротеины можно использовать в тех или иных случаях и как следует создавать новые, обладающие заданными свойствами», — прокомментировал Валентин Борщевский, заместитель директора Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ.
Соавтор статьи, старший научный сотрудник МФТИ Михаил Шевцов, кристаллизует белки при помощи высокоэффективного робота.
Биофизики из Красноярска и Долгопрудного при участии коллег из Германии и Франции в своей работе исследовали работу одного из наиболее изученных светящихся кальций-зависимых белков — обелина. Они проверили, как изменяется структура этой молекулы с синтетическим аналогом природного люциферина, использование которого должно смещать свечение в красную область спектра. Свечение в этой области позволяет наблюдать за внутриклеточными процессами не только на культурах клеток, но и в организмах мелких лабораторных животных, так как красный свет лучше проникает через биологические ткани, минимально повреждая их.
«В этой работе нам удалось получить трехмерную структуру белка обелина в комплексе с синтетическим аналогом природного люциферина, который сдвигает биолюминесценцию в красную область. Однако интенсивность свечения с этим аналогом значительно ниже, чем с природным люциферином. Определив структуру, мы нашли, что продуктом реакции является целентерамин, тогда как при использовании природного люциферина — целентерамид. Так как образование целентерамина происходит в результате реакции, идущей без излучения света, его обнаружение объяснило низкую интенсивность свечения обелина с этим аналогом», — рассказал Павел Наташин, кандидат биологических наук научный сотрудник лаборатории фотобиологии Института биофизики КНЦ СО РАН.
«Для структурных исследований нам были необходимы белковые кристаллы обелина, для формирования которых мы подобрали подходящие условия. Определение пространственной организации белковой молекулы проводили с помощью метода рентгеноструктурного анализа. Данный подход позволяет с высокой точностью рассмотреть положение каждого атома в интересующей нас молекуле. Сравнивая, как меняется структура белка до и после свечения, мы делаем выводы о механизме реакции. Для этих исследований были использованы возможности Европейского центра синхротронного излучения», — пояснил Алексей Мишин, заместитель заведующего лабораторией структурной биологии рецепторов, сопряженных с G-белком, МФТИ.
«Понять процессы, протекающие на молекулярном уровне, очень непросто. Форма белковых молекул в ходе реакций меняется, одни соединения преобразуются в другие. В нашем случае все это сказывается на скорости или интенсивности свечения, а также спектре излучения. Мы разбираемся с механизмами функционирования различных биолюминесцентных белков уже несколько десятков лет. Конечная цель — научиться создавать светящиеся репортерные белки с заданными свойствами для различных аналитических приложений.
Например, в данной работе мы показали, что синтетический аналог люциферина неэффективно работает с обелином, но обеспечивает сравнимую с природным люциферином интенсивность излучения с некоторыми другими светящимися молекулами. Это дает нам основание подумать, как “подправить” фотопротеин с помощью точечных замен аминокислот, которые снизят или исключат возможность протекания темновой реакции», — резюмировал Евгений Высоцкий, кандидат биологических наук заведующий лабораторией фотобиологии Института биофизики КНЦ СО РАН.
Исследование структуры и фотохимических характеристик свечения белка обелина в комплексе с кальцием и различными химическими соединениями помогает объяснить особенности функционирования этого белка. Ученым удалось понять, что влияет на интенсивность свечения молекулы с измененным цветом свечения. Работа расширит возможности применения данного инструмента в биомедицинских целях.
__________________________________
Исследование выполнено в рамках договора о сотрудничестве между Центром исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ и Институтом биофизики СО РАН при поддержке Минобрнауки РФ, грантов РНФ, РФФИ, Правительства Красноярского края и Красноярского краевого фонда науки.
