Российские генетики разработали протокол выделения ДНК льна, который сделал возможным получение большого выхода чистой высокомолекулярной ДНК даже с одного растения. Секвенирование такой ДНК на платформе третьего поколения позволило выполнить сборку генома льна высокой протяженности и полноты, что является основой для дальнейших молекулярно-генетических исследований и селекции этой культуры. Результаты исследования опубликованы в International Journal of Molecular Sciences.
Научный коллектив Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта (ИМБ) РАН совместно с исследователями из Федерального научного центра лубяных культур и Московского физико-технического института (МФТИ) разработал протокол выделения ДНК льна, включающий стадию изоляции клеточных ядер, который позволяет получить чистую высокомолекулярную ДНК. Используя созданный протокол, удалось даже с одного растения выделить достаточное количество ДНК для достижения большого выхода длинных чтений на платформе Oxford Nanopore Technologies (ONT), которая крайне чувствительна к качеству материала. Из полученных данных ученые собрали геном льна высокой протяженности и полноты.
Сегодня лен (Linum usitatissimum L.) широко используется в различных областях и становится все более востребованным. Льняное семя богато лигнанами, омега-3 и клетчаткой, что делает его полезной пищевой добавкой, а также сырьем для фармацевтической и косметологической промышленности. При производстве эмалей и лакокрасочных материалов масло льна используется для увеличения стойкости материала. Льняное волокно применяется для создания одежды, бумаги, медицинских изделий, утеплителей, порохов и композитных материалов. Каждое из этих применений требует возделывания сортов льна с определенным набором характеристик. Для получения растений с конкретными признаками используют селекцию, при этом знание генетических основ, детерминирующих эти признаки, позволяет значительно повысить эффективность создания специализированных сортов. Доступная высококачественная сборка генома растения — это необходимый инструмент для изучения ценных признаков сельскохозяйственных культур. Получение генома из материала с одного растения делает возможным совместный анализ генотипа и фенотипа. К сожалению, универсального подхода к построению качественной сборки генома не существует. Конечный результат зависит от самой структуры генома, выбранной платформы, объема и качества данных секвенирования.
В ходе исследования семена льна линии 3896 проращивали в чашках Петри, после чего высаживали в горшки с почвой. Когда растение достигало возраста в три-четыре недели, его частично накрывали темной тканью, защищающей от света, и растили еще одну неделю. Такая процедура позволяет уменьшить количество метаболитов в клетках растений для выделения более чистой ДНК. После роста в темноте проводили сбор листьев и немедленную их заморозку в жидком азоте. Собранный материал хранили при –70 °С до момента выделения клеточных ядер с последующей изоляцией ДНК.
«Нами разработан протокол изоляции ядер льна с последующим выделением ДНК, позволяющий из 0,5 г листьев выделить около 5 мкг чистой высокомолекулярной ДНК. Такой объем материала можно собрать даже с одного растения и получить более 30 млрд нуклеотидов длинными чтениями ONT», — рассказала Екатерина Дворянинова, сотрудник лаборатории сравнительной геномики и транскриптомики ИМБ РАН, аспирант МФТИ.
Для секвенирования использовали платформу третьего поколения ONT, позволяющую получать чтения длиной до миллионов нуклеотидов, что крайне важно для сборки протяженных геномов. Так как приложения для сборки геномов разрабатываются на основе разных алгоритмов, результат их работы зависит от качества и количества полученных данных секвенирования, а также от структуры самого генома.
Для выбора наиболее подходящего метода сборки тестировали восемь востребованных приложений-сборщиков. Качество сборок ученые оценивали с точки зрения полноты и непрерывности — оптимальная сборка генома должна быть полной, то есть содержать все обязательные консервативные участки, и протяженной, то есть состоять из как можно меньшего количества частей. Далее применялась так называемая процедура «полировки», которая используется для повышения точности полученной геномной сборки. Для выбора оптимальной схемы «полировки» также проводился сравнительный анализ востребованных на сегодняшний день приложений. В результате разработан алгоритм создания высококачественной сборки генома льна: от выращивания растений до биоинформатической обработки данных секвенирования.
«В нашем исследовании подчеркивается влияние выбранной стратегии построения генома на полученные параметры сборки и ее пригодность для будущих молекулярно-генетических исследований», — резюмирует Алексей Дмитриев, руководитель лаборатории сравнительной геномики и транскриптомики ИМБ РАН.
Геномы представителей одного и того же вида растений могут значительно отличаться друг от друга. Высококачественные геномные сборки позволяют выявить такие различия и перейти на ступень пангенома — совокупности нуклеотидных последовательностей всех представителей вида, что выводит исследования этого вида на новый уровень. Разработанный учеными алгоритм получения высококачественного генома льна необходим для создания пангенома этой культуры и будет способствовать селекции сортов с заданным комплексом характеристик и еще более широкому использованию этого ценного растения.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации.
