Когда COVID-19 бросил невиданный прежде вызов мировой науке, им занялись научно-исследовательские учреждения всех стран. Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН успешно использовал свои многолетние достижения для создания теста на коронавирус и разработки вакцин и лекарств от ковида.
«Мы занимаемся антителами почти тридцать лет. Еще в начале 90-х в Science вышла первая публикация, посвященная открытым нами каталитическим антителам, гидролизующим ДНК. Кроме того, у нас в институте очень сильны направления генной инженерии, трехмерного рентгеноструктурного анализа. Мы активно работаем с аутоиммунными процессами, антибиотиками. Поэтому идея заняться тестами на коронавирус возникла совершенно закономерно: эта тема нам определенно по силам», — рассказывает академик Александр Габибов, директор ИБХ РАН и руководитель исследования.
![антитело](https://zanauku.mipt.ru/wp-content/uploads/2020/11/DSC_7057-e1604308487867.jpg)
Барельефы отцов-основателей института — академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
В Институте биоорганической химии занялись одновременно и вакциной, и тестом. Начали в апреле. Тогда казалось, что много времени было потеряно, но тем не менее в мае тест-система была уже готова к клиническим испытаниям. Над вакцинами работа продолжается.
Даже с учетом огромных возможностей такого института два месяца — чрезвычайно короткий срок для серьезной научной разработки, особенно в условиях пандемии.
Азбука иммунологии
Когда Александр Габибов принял решение поручить своим сотрудникам борьбу с коронавирусом, он сформировал команду специалистов из разных лабораторий и опытного производства института.
Для людей с таким гигантским опытом в генной инженерии антител идея выглядела вполне убедительно. Тест работает на определение количества в крови человека белков плазмы крови — антител, возникающих на определенных этапах болезни. Это называется «иммуноферментный анализ». Из пяти типов антител, присущих человеку, с точки зрения вирусных болезней интересны три: иммуноглобулины A, M и G. Ученые обозначают их IgA, IgM и IgG соответственно.
![антитело](https://zanauku.mipt.ru/wp-content/uploads/2020/11/DSC_7055-e1604308866637.jpg)
Академик Александр Габибов представляет тест-систему. В одной коробке — набор, достаточный для тестирования 196 человек
Иммуноглобулин А производится клетками слизистых оболочек, — например, легких. Коронавирус нового типа заражает именно такие клетки, поэтому IgA — самый важный для тестирования. Антитела IgA появляются в крови человека уже на второй-третий день и остаются в ней до конца болезни.
Чуть позже, на пятый-шестой день, появляются антитела IgM. Ближе к концу болезни, примерно на третьей-четвертой неделе они сменяются иммуноглобулином G. Именно наличие IgG имеют в виду, когда говорят про иммунитет к вирусу.
Даже когда человек выздоравливает и все остальные специфичные к вирусу антитела пропадают, IgG у него остаются. Эти антитела обеспечивают человеку иммунитет: должны пройти месяцы после болезни, чтобы количество иммуноглобулина G упало до необнаруживаемого уровня.
Тест-системы, разработанные в Институте биоорганической химии, способны обнаруживать в сыворотке или плазме крови человека антитела сразу трех классов — IgM, IgG, IgA, — и это значительно повышает их специфичность. Специфичность отражает долю отрицательных результатов, которые правильно идентифицированы именно как отрицательные, то есть вероятность того, что здоровые люди будут классифицированы как небольные.
![антитело](https://zanauku.mipt.ru/wp-content/uploads/2020/11/Snimok-ekrana-ot-2020-08-22-19-21-06.png)
Начало заболевания (недели)
Ловушка для антитела
Получается, по мере течения болезни набор иммуноглобулинов в крови человека однозначно меняется. Например, присутствие IgA и IgM говорит о начале заболевания, а всех трех классов антител сразу — о его конце. Поэтому достаточно поймать в крови иммуноглобулины и отличить их друг от друга. Задача создателей теста свелась, таким образом, к поиску хорошей «наживки».
Раньше в таких случаях использовали белки, выделенные из оболочки самого вируса. Но наука не стоит на месте, и сейчас ученые уже могут создавать копии частей вируса искусственно — достаточно знать его генетическую последовательность. Из нее вырезают кодирующий нужный белок кусочек и вставляют его в геном кишечной палочки. Кишечная палочка считает такого подкидыша своим и производит чужой белок наравне с остальными. Такие белки — точные копии настоящих, но созданные в пробирке, называются рекомбинантными.
Длина структурных белков коронавирусов может быть от 73 до 1 273 аминокислотных остатков. Ученым ИБХ удалось подобрать фрагменты белков из таких мест и такой длины, что тест получился очень эффективным. И кишечную палочку E.coli в качестве основы тоже выбрали не случайно: этот выбор сильно удешевляет производство. В ИБХ РАН имеется большой опыт использования подобной технологии и получения продуктов в условиях собственного лицензированного биотехнологического производства.
Ученые решили взять не один, а три рекомбинантных белка, по реальным прообразам которых антитела узнают вирус. Их поместили в лунки планшета и закрепили на нем. Теперь, если в этот же планшет нанести сыворотку крови человека, находящиеся в ней антитела примут искусственные белки за настоящие и свяжутся с ними. После этого планшет промывают специальным раствором, и в результате все лишнее устраняется.
![антитело](https://zanauku.mipt.ru/wp-content/uploads/2020/11/Snimok-ekrana-ot-2020-08-30-17-01-19.png)
После обработки флюоресцентным составом на плашке проявляются разные цвета для каждого антитела. По их комбинации делают выводы о статусе болезни
Эффективность доказана
Клинические испытания тест-системы проводили совместно с Центральной клинической больницей РАН. Двое сотрудников института работали в «красной зоне» больницы.
Всего на базе ЦКБ РАН протестировали более пятисот человек. Результаты соответствовали симптоматике: положительный результат теста подтверждался клиническими наблюдениями. Параллельно результаты работы тест-системы сравнивали с зарегистрированным набором АО «Генериум».
Оба теста практически полностью совпадали по положительным и отрицательным результатам, но тест-система ИБХ РАН оказалась более чувствительной. Было меньше случаев появления сомнительного — ложноположительного или ложноотрицательного — результата.
Перебором различных компонентов и методик испытания ученым удалось снизить число людей с сомнительным результатом до 2%, не потеряв в итоговой точности. Так как тесты обычно делают три раза, то риск ложноположительного или ложноотрицательного результата падает в итоге до десятитысячных долей процента.
Александр Габибов, академик, директор ИБХ РАН:
— Во-первых, мы расширили спектр белков-носителей антигенных детерминант в составе тест-системы до трех. Во-вторых, использовали смесь конъюгатов к диагностически важным классам антител — IgA, IgG, IgM. В-третьих, получение рекомбинантных белков, входящих в тест-систему, не связано с клетками млекопитающих или насекомых, а предполагает использование бактериальной культуры. Это более выгодно с точки зрения затрат.
Работа на предупреждение
«Наша группа занимается прежде всего вакцинами. Тест — это скорее побочный продукт», — признается Татьяна Бобик, научный сотрудник ИБХ РАН и один из руководителей исследования.
Одновременно с разработкой тест-системы в Институте биоорганической химии идет создание двух вариантов вакцины к SARS-CoV-2. Первая идея — та, из которой и родился тест, — основана на вирусоподобных частицах. Так называют вирусы, лишенные генетического материала и, следовательно, незаразные. Если к вирусоподобной частице прицепить фрагменты коронавируса, то организм примет ее за настоящий коронавирус и выработает иммунитет.
Ученые ИБХ РАН конструируют вирусоподобные частицы на основе гепатита B со спайк-белком коронавируса на поверхности. Спайк-белок отвечает за проникновение вируса в клетку: он взаимодействует с рецепторами на оболочках эпителиальных клеток, выстилающих легкие. В ответ на введение такой частицы в крови появятся антитела, «узнающие» спайк-белок. Они защитят клетки, если организм столкнется с настоящим коронавирусом.
Пока есть технические проблемы: не получается добиться контролируемой сборки вирусоподобных частиц. На примете у исследователей имеется еще один вариант антигена (белка, к которому могут выработаться антитела) — в виде внутреннего нуклеокапсидного белка. Ученые продолжают искать оптимальный способ собрать нужную частицу.
![антитело](https://zanauku.mipt.ru/wp-content/uploads/2020/11/DSC_7001-1-1024x683.jpg)
Выпускница ФБМФ МФТИ Маргарита Баранова работает над комбинированной ДНК-белковой вакциной
Вторая разработка — ДНК-белковая вакцина. В мире исследуются более 100 кандидатных вакцин против SARS CoV 2, однако описываемая вакцина не имеет аналогов и использует способ вакцинации, объединяющий подходы nucleic acid based и protein based.
Принцип ее работы в том, чтобы доставить в клетку последовательность ДНК, кодирующую тот же самый спайк-белок. Тогда собственные клетки человека начнут производить его, и выработается иммунный ответ. Такие частицы уже созданы совместно с компанией «Фармсинтез», но исследование пока не закончено.
Иван Смирнов, заместитель директора по научной работе:
— Мы уже провели первый раунд испытаний с 16 вариантами вакцин и выбрали из них три, которые дали самый высокий уровень нейтрализующих антител. Это те антитела, которые не только связываются с антигеном, а еще и препятствуют вирусу взаимодействовать с клетками. По сути, ведь цель вакцины — защитить организм, а для этого нужны нейтрализующие антитела. Сейчас мы запускаем второй раунд оценки, уже более прицельный.
Исследования биологической активности и безопасности ведутся на базе Испытательного центра института в Пущино на лабораторных животных. Создаваемый препарат будет проверен на трансгенной линии мышей с человеческим рецептором.
Что будет дальше
Тест-система и вакцины — не единственные проекты Института биоорганической химии по борьбе с COVID-19. Программа противодействия коронавирусу включает еще и создание лекарств на основе нейтрализующих антител. Ученые разрабатывают терапевтические нейтрализующие моноклональные антитела, которые могут служить заменителем сыворотки переболевших. Это будет генно-инженерное человеческое антитело.
![антитело](https://zanauku.mipt.ru/wp-content/uploads/2020/11/IBH2-1024x682.jpg)
Коллектив сотрудников ИБХ РАН, принимавших участие в разработке тест-систем (слева направо): Никита Костин, Георгий Скрябин, Юлиана Мокрушина, Александр Габибов, Мария Симонова, Полина Цабай, Татьяна Бобик, Иван Смирнов. Фото: ИБХ РАН
Идет разработка вирус-нейтрализующего препарата на основе растворимой части человеческого рецептора ACE2 и иммуноглобулина G (ACE2-Fc). Это будет противовирусный препарат широкого спектра действия. Уже завершено получение генетической конструкции, проводятся эксперименты по тестированию препарата.
Идет сбор материала для серьезного геномного исследования. «Уже понятно, что не у всех людей возникает одинаковый ответ вирусу. Итальянцы, китайцы, американцы исследуют генетическую предрасположенность на своих популяциях. Мы занимаемся сбором данных по людям с российскими корнями. Для этого необходимо делать полное геномное секвенирование и сравнивать геномы, искать корреляции. Министерство науки и высшего образования предоставило нам дополнительное финансирование — тридцать миллионов рублей. Мы решили потратить их на исследование связей между генотипами больных и течением заболевания у молодых пациентов без сопутствующих хронических заболеваний, — рассказывает Александр Габибов. — Ковид вообще затронул самые основы фундаментальной науки. Вот так же в 80-е годы, когда появился СПИД, очень сильно поднялась наука иммунология. И сейчас тоже происходит гигантский рывок во многих научных направлениях».
1