ДНК-ножницы

Нобедевские лауреаты 2020 по химии Дженнифер Дудна и Эммануэль Шарпантье

Шведская королевская академия наук присудила Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Дудна Нобелевскую премию по химии 2020 года за разработку метода редактирования генома. С тех пор, как была открыта структура ДНК, ученые пытались разработать технологии редактирования генома клеток. С открытием системы CRISPR-Cas9 появился простой и эффективный метод геномной инженерии. Развитие  этой технологии позволило ученым менять последовательности ДНК, прицельно разрезая геном в заранее заданных местах. Сегодня технология CRISPR-Cas9 широко используется в фундаментальной науке, биотехнологиях и при разработке генетических лекарств.

 

Иммунитет бактерий

В 1987 году в геноме кишечной палочки была обнаружена необычная повторяющаяся структура из 29 нуклеотидов. Эти повторы перемежались разными последовательностями схожей длины. Позже анализ известных геномов показал, что подобные повторы часто встречаются у бактерий и все содержат одни и те же характерные особенности: одинаковые короткие, частично симметричные элементы, разделенные уникальными промежуточными последовательностями постоянной длины. Тогда же был введен термин CRISPR — аббревиатура для кластеризованных коротких палиндромных повторов с регулярными интервалами. Позднее исследователи обнаружили, что уникальные последовательности CRISPR были получены биологами ранее из бактериофагов и плазмид, которые опасны для одноклеточных организмов. Бактерии, геном которых содержит эти специфические последовательности, оказались защищены от токсичного воздействия бактериофагов. Оказалось, что при транскрипции CRISPR образуются длинные молекулы РНК (crRNA), которые связываются со специальными Сas-белками. После этого Сas-белки разрезают чужеродную ДНК, а ее хозяин погибает.

Илья Манухов, заведующий лабораторией молекулярной генетики МФТИ:

Есть задача встраивания куска ДНК с необходимой последовательностью в  хромосому, в живую клетку. Это может произойти вследствие обмена частями между имеющейся в клетке ДНК и той, которая добавляется, — процесс называется рекомбинацией. Частота такого обмена — примерно одна на миллион клеток в обычных условиях, поэтому сделать целевую мутацию в хромосоме нелегко. Однако если мы разрежем ДНК клетки в месте, куда хотим вставить нужный участок, рекомбинация становится достаточно частой. Все современные методы редактирования генома направлены на разрезание ДНК. До того, как была сделана система CRISPR-Cas9, для каждого разреза делали белки с помощью генной инженерии (TALENs, или zinc-finger nucleases), которые узнавали длинную последовательность ДНК. Каждый раз, чтобы разрезать ДНК в нужном месте, нужно было сделать новый белок, чтобы он узнавал нужное место. Это, все-таки, неудобно и требует большого объема работы — изготовление нового фермента может занимать до нескольких месяцев. Система CRISPR-Cas9 разрешила эту задачу. Берется один белок, который узнает последовательность на РНК, целевая РНК синтезируется прямо в клетке, что гораздо быстрее и дешевле, и ДНК разрезается в нужном месте.

За последние 25 лет было найдено много разных систем CRISPR-Cas, которые разделены на два основных класса. В системах класса 1 cas-белки собираются в большой комплекс, связанный с crRNA. Системы класса 2 проще и содержат единственный связанный с crRNA белок (например, Cas9). Эти системы разрезают патогенные молекулы, используя информацию, записанную в CRISPR.

CRISPR-повторы в организмах прокариот без мембранных органелл обнаружил Франсиско Родригес-Валера. Сегодня он возглавляет лабораторию теоретических и компьютерных исследований макромолекул и геномов в МФТИ.

Франсиско Родригес-Валера, заведующий лабораторией теоретических и компьютерных исследований макромолекул и геномов МФТИ:

Я очень горжусь тем, что в основе этой футуристической технологии лежит случайное открытие, которое произошло в моей лаборатории в Испании в начале 1990-х годов. Мы секвенировали фрагменты генома галофильных архей в поисках областей, которые по-разному экспрессировались в зависимости от солености среды обитания. Мы описали массив CRISPR в галоархее Haloferax mediterranei (микроб, который я лично выделил).  Мы даже назвали их TREP, тандемные повторы, но мы неправильно поняли назначение последовательностей и предположили, что это была система разделения хромосом между двумя дочерними клетками. Многие открытые геномы содержали эти TREP, но, похоже, никто их не видел, и никто не решался предположить их функцию. Шарпантье и Дудна вместе с другими сотрудниками, включая моего бывшего студента Хесуса Гарсиа Мартинеса из Университета Аликанте, поняли, что вариабельные части повторов напоминают плазмиды или бактериофаги, которые иногда обнаруживаются в организмах, которым принадлежат повторы. Это привело их к предположению, что функция этих повторов — действовать как клеточная иммунная система. 

Открытие системы CRISPR-Cas9

К 2011 году стало ясно, что системы CRISPR-Cas широко распространены у прокариот и действуют как иммунные системы для борьбы с опасными внешними ДНК-фрагментами. При попадании в клетку враждебной ДНК комплекс CRISPR-Cas разрезает ее, а хозяин враждебной ДНК погибает. CRISPR-Cas9-система была найдена у опасного для человека стрептококка. Его CRISPR-система второго типа содержит четыре Cas-белка, три из которых участвуют в записи обнаруженных опасных ДНК между повторами CRISPR, а четвертый (Сas9) необходим для разрезания чужеродной ДНК. Для дальнейшего определения элементов, необходимых для иммунитета, система CRISPR-Cas родственника стрептококка была введена в клетки кишечной палочки, где она обеспечивала защиту от заражения фагами и плазмидами. Используя эту экспериментальную модель, ученые убирали разные части системы, чтобы определить минимальный набор необходимых компонент. Оказалось, что одного белка Cas9 достаточно для стадии разрезания чужеродной ДНК, кодируемой CRISPR-системой, и что для этого эффекта необходимы два присутствующих в белке активных участка.

Открытие второй важной РНК нобелевским лауреатом

В 2011 году Эммануэль Шарпантье исследовала механизмы созревания crRNA у стрептококка. Неожиданно она обнаружила, что вместе с crRNA всегда синтезируется дополнительный участок на расстоянии около 210 нуклеотидов. Эта цепочка была обозначена как транскодируемая малая РНК (tracrRNA) и содержала один повтор CRISPR. Ученые предположили, что две РНК могут совместно участвовать в работе CRISPR-Cas. Также Шарпантье обнаружила, что белок Cas9 способствует правильной обработке РНК, поскольку при нарушении гена Сas9 в бактериях останавливается созревание как tracrRNA, так и crRNA. Основываясь на своих выводах, Шарпантье и соавторы предположили, что белок Cas9 действует как молекулярный якорь, который облегчает спаривание tracrRNA и crRNA.

Павел Волчков, заведующий лабораторией геномной инженерии МФТИ:

Можно сейчас взять любой фильм, где описывается будущее с небольшими вкраплениями молекулярной биологии, — таких немного на самом деле, но тем не менее они есть. И да, вот так и будет. С открытием данного инструмента только наша фантазия и наши финансовые возможности нас ограничивают.

Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Дудна начали сотрудничество, чтобы исследовать, можно ли использовать crRNA для управления работой белка Cas9. Они обнаружили, что добавление crRNA к очищенному Cas9 не может стимулировать расщепление ДНК белком. В то же время добавление tracrRNA запустило разрезание целевого гена. Получается, tracrRNA имеет две критических функции — это запуск созревания crRNA и последующая активация crRNA-управляемого расщепления ДНК с помощью Cas9. В серии экспериментов исследователи изучили механизмы реакции расщепления ДНК. Оказалось, что каждый из двух доменов в Cas9 расщепляет одну цепь целевой ДНК. Причем разрезается ДНК на расстоянии трех нуклеотидов от последовательности NGG, где N — любой из четырех нуклеотидов. Такая последовательность потом была названа PAM. Ее наличие необходимо для расщепления двухцепочечной ДНК. Шарпантье и Дудна позже придумали, как можно склеить tracrRNA и crRNA в одну длинную РНК таким образом, чтобы CRISPR-Cas9 нацелился на нужную молекулу ДНК. Так они создали простую двухкомпонентную систему, содержащую склеенную РНК и белок Cas9, которую можно было запрограммировать на произвольное расщепление последовательностей ДНК.

 

Действие CRISPR-Cas системы

Сегодня ученые понимают, как комплекс распознает свою мишень и запускает расщепление ДНК. Структура Cas9 имеет две отдельные части: часть узнавания целевой ДНК и режущую ДНК долю с двумя активными участками — доменами, каждый из которых расщепляет одну из нитей полимера.

Для распознавания целевого участка РНК должна образовывать комплементарные пары с последовательностью ДНК. В структуре комплекса Cas9 с РНК нуклеотиды принимают нужное положение, чтобы иметь возможность соединиться с ДНК. При этом последовательность PAM также должна присутствовать рядом с мишенью. Белок Cas9 сначала ищет последовательность PAM, а после обнаружения исследует возле нее ДНК на предмет комплементарности с РНК в комплексе. Взаимодействия между PAM и комплексом приводят к расхождению цепей ДНК, после чего РНК связывается с комплементарным участком ДНК при его наличии.

Как только образуется стабильное соединение между РНК и ДНК, Cas9 активируется и расщепляет ДНК. Каждый из двух активных участков в составе белка разрезает одну цепь целевой двухцепочечной ДНК в определенном месте длиной на расстоянии 3 нуклеотидов от последовательности PAM. При мутации одного из двух доменов может образоваться одноцепочечный разрыв. Это очень полезно для практического применения CRISPR-Cas, так как они могут быть запрограммированы для нацеливания на противоположные цепи и, таким образом, делать разрезы в целевой ДНК с одной продленной нитью.

Система CRISPR-Cas9 открыла широкие возможности для редактирования геномов. Уже сегодня с ее помощью в ранних эмбрионах мышей исследователи вырезают некоторые гены или вставляют дополнительные. CRISPR-Cas9 позволяет при определенных условиях редактировать и геном человека, поэтому чрезвычайно важно, чтобы технология тщательно регулировалась и использовалась ответственно. С этой целью Всемирная организация здравоохранения недавно учредила глобальную междисциплинарную группу экспертов для изучения научных, этических, социальных и юридических проблем, связанных с редактированием генома человека.