Журнал «За науку»: Существенный шаг к лечению болезни Альцгеймера

Процесс старения включает в себя различные нейродегенеративные заболевания, нарушающие сложную сеть метаболических и сигнальных путей. Болезнь Альцгеймера — самый распространенный в мире вид нейродегенеративного заболевания, которым ежегодно заболевает несколько миллионов человек, причем с возрастом вероятность развития этого вида деменции возрастает многократно. Сегодня уже более 50 миллионов человек во всем мире страдают от нейродегенерации, вызванной болезнью Альцгеймера, и ожидается, что из-за увеличения продолжительности жизни к 2050 году это число увеличится втрое.

Несмотря на прогресс в науке и медицине, на обширные исследования и огромное количество информации, полученной по различным аспектам болезни Альцгеймера, ее причины и молекулярные механизмы, связанные с патологией, остаются в значительной степени неизвестными, и по-прежнему не существует эффективного метода лечения и профилактики. При этом уже прошло 110 лет после того, как болезнь была впервые описана Алоисом Альцгеймером как форма прогрессирующего нейродегенеративного и поведенческого расстройства. Сейчас мы знаем, что клинические проявления болезни Альцгеймера объясняются избирательной дегенерацией нейронов в участках коры головного мозга, ответственных за когнитивное восприятие и память.

Научная группа из Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ и Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН провела экспериментальное исследование взаимодействия перспективного лекарственного средства и прекурсора пептида бета-амилоида, вовлеченного в нейродегенерацию. Результаты исследований являются существенным шагом к решению застарелой проблемы всего человечества — лечению болезни Альцгеймера. Статья опубликована в Journal of Medicinal Chemistry.

Образование Aβ в норме и в патогенезе

Известно, что в патогенезе болезни Альцгеймера задействованы различные пептиды и белки, в том числе амилоидогенные: прежде всего, бета-амилоидный пептид (Aβ), а также взаимодействующие с ним Тау-белок и прионный белок PrP. Вне нервных клеток, в местах контакта нейронов, накапливается пептид Aβ, который собирается в протяженные упорядоченные структуры — фибриллы, формирующие так называемые амилоидные бляшки. На настоящий момент предложенные методы лечения основаны на разрушении внеклеточных отложений Aβ, но это может привести к получению гораздо более опасных малых олигомеров* Aß, способных воздействовать на функцию амилоидогенных белков (таких, как Тау-белок и белок PrP), мембранных рецепторов и каналов (например, рецептор RAGE, никотиновый ацетилхолиновый рецептор), а также на функцию внутриклеточных органелл (таких как лизосомы и митохондрии), приводя к угнетению функции нейронов и клеточной смерти.

Нормальная биологическая функция пептида β-амилоида (Aβ) в значительной степени неизвестна. Тем не менее изоформы** Aβ различной длины встречаются у людей независимо от возраста и наличия проявлений болезни; пептиды в мономерной форме могут играть роль в сигнальных путях в головном мозге и, вероятно, могут иметь нейропротекторные свойства при низких концентрациях. Aβ и родственные пептиды являются продуктами последовательного гидролиза мембранного белка предшественника амилоида (amyloid precursor protein АРР) посредством протеолитических ферментов: α-, β- и γ-секретаз. На первой стадии созревания Aβ белок АРР расщепляется мембраноассоцированной β-cекретазой — аспартил протеазой BACE (β-сайт фермента, гидролизующего полипептидную цепь АРР), которая удаляет водорастворимый домен APP и оставляет мембранный С-концевой фрагмент из 99 аминокислот (CTFβ, С99) в мембране. CTFβ на следующем этапе гидролизуется большим мембранным белковым комплексом аспартилпротеазы, называемым γ-секретазой. В результате внутримембранного гидролиза по ε-сайту трансмембранного (TM) домена C99 из мембраны в цитозоль высвобождается внутриклеточный домен APP (AICD). При поэтапном процессе различные изоформы Aβ генерируются дополнительными расщеплениями γ-секретазой по ζ- и γ-сайтам. γ-секретаза гидролизует трансмембранный домен до тех пор, пока он не станет достаточно коротким — преимущественно 38–42 аминокислотных остатка. Далее изоформы Aβ высвобождаются из мембраны во внеклеточное пространство. Aβ1-40 образуется в качестве основного продукта вместе с небольшими количествами короткого Aβ1-38 и длинного Aβ1-42, который является наиболее гидрофобным и амилоидогенным1 (рисунок 1).

Схематическое изображение образования амилоидогенных пептидов Aβ (зелёным) построено с использованием экспериментально полученных структурных данных (номера структур по базе данных PDB указаны на схеме). Справа налево показан путь протеолитической деградации мембранного белка предшественника амилоида (amyloid precursor protein, АРР) с последующим образованием пептидов Aβ1. Справа указаны наиболее распространённые семейные мутации, ассоциированные с ранним развитием болезни Альцгеймера (кроме A2T).

D-пептиды — перспективный класс действующих веществ

Все изоформы пептидов Aβ склонны к ассоциации, и именно олигомеры играют решающую роль в патогенезе болезни Альцгеймера, оказывая токсическое действие на нейроны и их органеллы. Поэтому так называемый D-энантиомерный пептид D3 и его производные были разработаны профессором Дитером Вильбольдом (Prof. Dieter Willbold) для разборки и разрушения цитотоксических малых олигомеров Aβ2. На данный момент одно из D3-подобных соединений находится в фазе II клинических испытаний3.

Впервые получена структура комплекса

Недавно мы опубликовали результаты исследований4, где продемонстрировали, что пептид D3, стабилизирующий мономер Aβ, динамически взаимодействует с прилегающей к мембране областью мембранного белка предшественника Aβ — CTFβ (трансмембранного фрагмента APP672-726 или Aβ1-55 в нумерации по пептиду β-амилоида), содержащего последовательность Aβ1-42. Молекулярное моделирование, граничными условиями для которого являлись структурные данные высокого разрешения экспериментально полученные с помощью ЯМР, дает уверенность утверждать, что D3 нацелен на амилоидогенную область Aβ, тем самым он ингибирует ранние стадии приобретения пептидом Aβ β-конформаций характерных для малых токсичных олигомеров (рисунок 2).

Рисунок 2. С использованием экспериментально полученных структурных данных представлено схематическое изображение действия пептида D3 (показан фиолетовым цветом) на CTFβ1-55 (мембрано-ассоциированный пептид в нижней части рисунка)4 с последующим образованием комплексов D3:Aβ1-42 (в левой верхней части рисунка, модели структур5 любезно предоставлены Dr. Jennifer Loschwitz) и ингибированием образования токсичных олигомеров Aβ6 (в правой верхней части рисунка).

В публикации мы также представили структурные и биохимические данные, которые показывают, что D3, как и Aβ1-42, является неупорядоченным белком (intrinsically disordered protein, IDP), а при взаимодействии D3 и Aβ1-55 образуется подвижный, но устойчивый комплекс, в котором конформации обоих полипептидов постоянно изменяются с изменением паттерна межмолекулярных контактов. Такие динамические межмолекулярные взаимодействия D3-пептидов лежат в основе их молекулярного механизма разрушения цитотоксических β-амилоидных олигомеров, а именно подавления контактов между Aβ пептидами и сохранения их в α-спиральной конформации, что предотвращает их переход в β-тяжи.

Трудности и результаты

Самые современные методы позволяют интенсифицировать изучение IDP белков, но некоторые эксперименты были проведены нами на грани чувствительности приборов. Например, сбор сигнала в экспериментах ЯМР занимал до 3 дней. Этого времени достаточно для агрегирования фрагментов Aβ1-55, постепенного их перехода в олигомеры и фибриллы (в особенности для фрагментов, несущих «альцгеймеровские» мутации, например, «австралийскую» L723P7), но эксперименты удалось провести успешно. Особенность проведённых экспериментов заключается и в том, что было исследовано перспективное лекарственное средство на основе D-пептида — представителя нового перспективного класса действующих веществ. Так же нами впервые была экспериментально получена структура D-пептида в комплексе с Aβ — при этом в динамически изменяющемся комплексе. Детальное понимание структурной динамики IDP белков, в частности, молекулярного механизма действия ингибиторов олигомеризации Aβ способствует определению молекулярных мишеней и разработке перспективных лекарственных средств для лечения и профилактики болезни Альцгеймера.

Исследования были выполнены в рамках проекта поддержанного РНФ (20-64-46027), они являются результатом эффективного многолетнего научно-технического сотрудничества России и Германии, коллаборации между МФТИ и Исследовательским центром г. Юлих (Forschungszentrum Jülich, FZJ) начиная с 2000-х годов.

*) Олигомеры пептида β-амилоида — несколько сгруппированных вместе в пространстве молекул пептида β-амилоида. Считается, что олигомеры образованные 6-20 пептидами наиболее токсичны для нейронов мозга. Олигомеры могут не иметь чёткой структурной организации и различаются между собой. Молекулы мономеров пептида β-амилоида входящие в состав олигомера могут взаимодействовать друг с другом неспецифически (см рис.21).

**) Изоформы пептида β-амилоида — очень близкие формы пептида β-амилоида. Понимаются широко: могут отличаться на один или несколько аминокислотных остатков, известны изоформы образованные из-за “семейных” мутаций (например, Aβ1-42(D23N), Aβ1-42(H6R)) или в результате протеолитического гидролиза γ-секретазы (например, Aβ1-42, Aβ1-40, Aβ1-45), β-секретазы (например, Aβ3-42, Aβ4-42) (см рис.11).