Значение кислотности среды (выражаемое численно с помощью показателя pH) внутри живых клеток представляет собой важнейший параметр внутренней среды организма, который строго регулируется. Существенные отклонения от нормального значения рН в цитозоле клеток человека наблюдаются, например, при злокачественной трансформации или, наоборот, могут инициировать процесс гибели клеток. Исследователи из Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ научились изменять кислотность цитоплазмы клеток человека с помощью света. Работа опубликована в журнале International Journal of Biological Macromolecules.
Оптогенетика — научное направление, в рамках которого исследователи используют светочувствительные белки для контроля определенных функций живых клеток. Оно развивается уже около 20 лет. Оптогенетика зародилась как способ контроля возбуждения нервных клеток (нейронов) и произвела настоящую революцию в нейробиологии. Однако в последнее время появляется все больше научных сообщений об использовании подходов оптогенетики для контроля обмена веществ, химических реакций и других физиологических функций в невозбудимых клетках.
Основные результаты исследования и их потенциальное применение комментирует Анастасия Власова, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник лаборатории молекулярной клеточной биологии и оптогенетики МФТИ.
Основными инструментами оптогенетики с момента ее возникновения служат микробные родопсины — мембранные белки, многие из которых способны переносить ионы через биологические мембраны под действием света. Функционально среди микробных родопсинов можно выделить большую группу протонных помп. Эти белки перекачивают протоны через мембраны под действием света. Интересно, что известны помпы, перекачивающие ионы в двух направлениях. Одни переносят протоны наружу, из клетки, их называют прямыми протонными помпами. Другие, работающие в обратном направлении, то есть закачивающие протоны в клетку, называют обратными помпами. Такие белки названы помпами, или насосами, потому что они способны переносить ионы, в данном случае ионы водорода, протоны, в область их большей концентрации (биологи говорят «против градиента концентрации»). Перенос ионов против градиента — это всегда работа, требующая затрат энергии. В данном случае родопсин использует для совершения работы энергию света.
Для целей контроля рН клеток человека нам было необходимо отобрать наиболее эффективные, мощные помпы из тех, с которыми мы работали. Для этого мы встроили гены этих белков в бактерии Escherichia coli и «заставили» клетки бактерий произвести родопсины в плазматической мембране. Проверить функцию родопсиновых протонных помп в таком случае несложно — достаточно измерять рН суспензии клеток E. coli. При освещении родопсин «включает» перекачку протонов, так что показатель рН изменяется. Но здесь была трудность: чтобы выбрать лучшие помпы, нужно было учесть их количество в клетке. К счастью, родопсины — это цветные белки, другими словами, они поглощают свет в видимом диапазоне. Поэтому мы смогли измерить поглощение суспензии клеток с помощью спектрофотометра и, таким образом, нормироваться на количество белка. Так мы смогли отобрать наиболее мощную прямую и обратную помпу. Зачем же это было нужно?
Дело в том, что рН цитозоля в клетках человека является жизненно важным параметром. В норме рН цитозоля составляет около 7,2 и не меняется более чем на несколько десятых. Отклонения рН цитозоля от нормального значения наблюдаются при ряде заболеваний. Причем отклонения могут быть как в одну, так и в другую сторону. Более щелочная цитоплазма наблюдается, например, у раковых клеток. Более кислая цитоплазма, наоборот, способствует клеточной гибели, например гибели нейронов. Существует даже гипотеза, что защелачивание цитоплазмы клеток приводит к ускорению их деления, а закисление — наоборот, к остановке и, возможно, гибели. Однако эта гипотеза еще требует тщательной проверки на клетках разных органов и тканей. Оптогенетические инструменты, которые сейчас есть в наших руках, могут помочь в подтверждении или опровержении данной гипотезы.
В нашей работе мы впервые смогли осуществить закисление цитозоля клеток HeLa при помощи мощной обратной протонной помпы ксеродоропсина из археи Nanosalina sp. Причем это закисление мы могли производить в нормальных, физиологических для клетки условиях. Мы также смогли изменять рН и в другую сторону, то есть защелачивать цитозоль с помощью прямой протонной помпы из археи Halorubrum sodomense. В большинстве исследований значения рН клетки авторы используют химические агенты, однако они не лишены побочных эффектов. Помимо этого, огромными преимуществами оптогенетического подхода являются высокая скорость, точность воздействия, а также малоинвазивность по отношению к клетке.
Сейчас мы продолжаем работу по исследованию физиологических последствий оптогенетического изменения рН цитозоля. В клетке все взаимосвязано, поэтому изменение рН ведет к целому каскаду последствий. Понять значения изменений внутриклеточного рН в норме и при патологии, а также установить верные причинно-следственные связи с использованием оптогенетического подхода — основная задача данных исследований.
1
