Коллектив исследователей Института биофизики будущего МФТИ и ИТМО разработал новый оптический метод, позволяющий с высокой точностью оценивать метаболические нарушения в живой сердечной ткани, вызванные недостатком кислорода (ишемией). Этот подход, основанный на анализе свечения молекулы энергии NADH, впервые позволил создать карты ишемического повреждения, устойчивые к главным помехам биологических образцов — рассеянию и поглощению света.
Результаты исследования позволят значительно повысить точность оценки жизнеспособности донорских сердец и мониторинг состояния пациента во время длительных операций на открытом сердце. Работа опубликована в журнале Chaos. Исследование поддержано грантом РНФ.
Фото: Magdaline John / Unsplash
Нарушения в клеточном энергетическом обмене и окислительно-восстановительном балансе являются признаками многочисленных хронических заболеваний, включая рак, диабет, нейродегенеративные и сердечно-сосудистые заболевания, ишемии. Эти нарушения часто проявляют тканевые и субклеточные особенности нашего организма, что увеличивает потребность в высокоточных методах оценки метаболической активности. Одна из многообещающих стратегий — визуализация молекулы NADH (никотинамидадениндинуклеотида) — ключевого переносчика электронов, при этом обладающего автофлуоресценцией в видимом диапазоне света. Благодаря активному участию NADH в клеточных биохимических процессах его можно считать простым маркером недостаточного снабжения тканей кислородом, позволяющим различать изменения в органах.
В последнее время интерес научного сообщества привлекает еще одно полезное свойство NADH. Наше сердце перекачивает кровь постоянно, и эта работа целиком зависит от бесперебойного снабжения энергией. Эту энергию сердечные клетки миокарда производят в электростанциях нашего организма — митохондриях, где ключевую роль играют молекулы — переносчики электронов, такие как NADH и его окисленная форма NAD+. Соотношение NAD+ / NADH и является одним из самых чувствительных индикаторов клеточного здоровья. Смещение в сторону NADH сигнализирует о «кислородном голоде», то есть ишемии.
«Мониторинг состояния тканей с помощью флуоресценции молекул NADH существует давно, но он подходил только для лабораторных экспериментов, где изменения состояния отслеживаются относительно референсного эксперимента (например с сильным дисбалансом потребления и поступления энергии), что недопустимо в реальной медицинской практике с донорскими органами.
Мы уже использовали естественную флюоресцентность NADH в наших предыдущих исследованиях. Это позволило установить, насколько такая флюоресцентная метка может дать точную информацию о состоянии ткани. В этом исследовании мы углубили свой поиск и изучили возможности использования NADH не только на культуре клеток, но и на самом сердце. Это позволит приблизить многообещающий метод к клинической практике и сразу перейти к анализу состояния органа без дополнительных замеров и экспериментов с ним»,— рассказал об исследовании первый автор Михаил Слотвицкий, старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной и клеточной медицины МФТИ.
Само уникальное свойство NADH — светиться под ультрафиолетовым светом — ученые пытаются использовать для визуализации ишемии в реальном времени уже более полувека. Однако препятствием на пути стояла физическая проблема: интенсивность свечения зависит не только от концентрации NADH, но и от оптических свойств самой ткани, которые непредсказуемо варьируются от точки к точке. Сигнал зависит как от концентрации биомаркеров, так и от сильно изменяющихся светорассеивающих свойств образца. Сердце — неоднородный, подвижный орган, и попытки сравнивать абсолютную яркость свечения часто оказывались бессмысленными, требуя сложных контрольных измерений в «нормальном» состоянии, которого у пациента или донорского органа может попросту не быть.
Российские ученые предложили новый подход, используя стабильное, поддающееся измерению состояние, возникающее в результате конкуренции двух враждебных процессов: «обратимого» фотолиза молекулы NADH (управляемого визуализирующим светом) и ее непрерывной ферментативной регенерации из NAD⁺. Они отказались от анализа абсолютной яркости в пользу изучения динамики. Результаты этого соревнования дают надежную, не зависящую от рассеяния, информацию о метаболической функции тканей.
«В ходе исследования мы обратили внимание на то, что сам процесс наблюдения за NADH в ходе ее облучения ультрафиолетом не является пассивным. Под действием света молекула NADH разрушается (фотолизуется), превращаясь в NAD+. Таким образом, в системе запускаются два противоположно направленных биохимических процесса: естественный, восстанавливающий NAD+ обратно в NADH (за который отвечает фермент глутаматдегидрогеназа, GDH) и искусственный, вызываемый светом процесс окисления NADH. Мы предположили, что это конкурентное взаимодействие приведет к установлению особого конкурирующего полуравновесия. При этом форма кривой затухания свечения NADH при постоянном облучении должна нести уникальную «подпись». Она связана с тремя ключевыми параметрами этого взаимодействия: скоростью фотолиза, активностью фермента GDH и исходным соотношением NAD+ / NADH»,— пояснил Михаил Слотвицкий.
Для экспериментальной проверки команда использовала изолированные сердца крыс, перфузируемые по методу Лангендорфа. Сердце останавливали кардиоплегическим раствором, чтобы исключить движение, и облучали короткими импульсами УФ-света с разной мощностью, одновременно регистрируя свечение NADH высокоскоростной камерой. Протоколы экспериментов были тщательно выверены: ученые оценивали влияние градиента проникновения света в ткань, проверяли линейность отклика и, что самое важное, искусственно вызывали ишемию, прекращая подачу питательного раствора, чтобы отследить изменения в динамике CSE.
Визуализация пространственных изменений CSE при оптическом отображении изолированного эпикарда сердца крысы. Подпанель (1) показывает фоновый сигнал; подпанели (2) и (3) — начальное и конечное распределение fNADH; и подпанель (4) — стандартное отклонение сигнала с течением времени (SD). На подпанели (4) показано наличие метаболических пятен в ROI (выделены черной пунктирной линией), которые не обнаруживаются при обычном изображении NADH. Источник: Chaos
Сначала исследователи построили математическую модель, которая подтвердила, что такая однозначная связь (биекция) действительно существует, и превратили главный недостаток долговременной NADH-визуализации — фотообесцвечивание — в источник ценнейшей информации. Конкурирующее полуравновесие выступает в роли встроенного калибратора, который позволяет «вычесть» влияние неоднородности ткани и сосредоточиться на чистой биохимии.
«Что нам дал эксперимент непосредственно с сердцем? Само сердце дает постоянный источник информации о метаболическом состоянии ткани, находится ли в балансе поступление и потребление энергии. Для его анализа используют электрофизиологические методы, но при кардиоплегической остановке сердца (при длительных операциях или при перевозке донорского сердца) они недоступны, и тут поможет такое метаболическое картирование.
В идеале с помощью нашей работы можно будет оценивать состояние сердца при длительной перевозке и для каждого конкретного органа предсказывать его пригодность к пересадке на данный момент. В целом метод будет применим и на других органах с высоким потреблением кислорода»,— подытожил Михаил Слотвицкий.
Практическое значение работы лежит в первую очередь в области кардиохирургии и трансплантологии. Кроме оценки донорских органов, метод может быть интегрирован в системы мониторинга во время длительных операций с искусственным кровообращением, позволяя в реальном времени отслеживать возникновение ишемии в различных отделах сердца.
На фундаментальном уровне открытие «метаболических пятен» GDH открывает новое направление в исследовании гетерогенности сердечной ткани и механизмов адаптации к хронической ишемии, что важно для понимания таких заболеваний, как стенокардия и сердечная недостаточность.
«Дальнейшие шаги нашей команды связаны с развитием двух направлений. С одной стороны, более сложные математические модели позволят учесть вклад других ферментов и создать еще более точный „цифровой двойник” метаболизма сердца. С другой стороны, упрощенная аналитическая модель уже сегодня открывает путь к созданию систем реального времени для операционных. Наша конечная цель — создать инструмент, который будет не просто диагностическим, а предиктивным»,— добавила руководитель работы Валерия Цвелая, заведующая лабораторией экспериментальной и клеточной медицины МФТИ.
Научная статья: M. M. Slotvitsky, M. S. Medvedev, G. S. Pashintsev, V. S. Kachan, S. A. Romanova, K. I. Agladze, V. A. Tsvelaya. A Reference-Free Optical Method for Assessing Cardiac Ischemia via NADH Autofluorescence Dynamics. Heart, 2026. Chaos 35, Issue 12 (2025). DOI: https://doi.org/10.1063/5.0297249
