Биофизики из Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ продолжают работать над созданием новых флуоресцентных белков — важного инструмента биологических исследований. На сей раз они использовали для этого ProteinMPNN — метод на основе нейронных сетей (а именно глубокое обучение), подбирающий аминокислотную последовательность для белка с исходно заданной структурой. Несмотря на то, что такие нейросети не предназначены для работы со связывающими небелковые молекулы (кофакторы) белками, они предложили модификации связывающего флавин флуоресцентного белка CagFbFP. Экспериментальная проверка показала, что все три синтезированных мутантных белка сохранили активность и стабильность, хотя их последовательность совпадает с исходной лишь на 55–66%. Опубликованный в журнале Protein Science результат показывает перспективность такого подхода белковой инженерии — не только для связывающих флавин, но и для имеющих кофакторы и лиганды белков в целом.
Белки — это разнообразные молекулы со сложной структурой, которые выполняют различные клеточные и биохимические функции. Они работают в качестве «арматуры», молекулярных машин, ускоряют химические реакции, избирательно транспортируют «полезные грузы» по клетке и в целом совершенно необходимы живому организму. Уникальные свойства белков напрямую определяются структурой, а та, в свою очередь, закодирована в их последовательности — то есть цепочке следующих друг за другом аминокислот.
Изучая связь структуры и функции белков, биологи поняли, что вполне могут взять на себя работу эволюции и создавать новые белковые молекулы, целенаправленно меняя их последовательность. Для этого используют белковую инженерию, то есть модификацию природных белков с помощью мутаций, либо создают новые, полностью искусственные молекулы «с нуля» — это уже так называемый белковый дизайн.
Одним из самых значимых достижений в биологии последних лет стал AlphaFold — метод искусственного интеллекта, которой эффективно предсказывает трехмерную структуру белков исходя из последовательности. Однако для создания новых белков требуется решить обратную задачу — подобрать такую последовательность, которая самопроизвольно свернется в молекулу с нужной формой. Такие методы уже доступны — к примеру, ProteinMPNN, основанный на глубоком обучении — разновидности машинного обучения с использованием нейронных сетей.
«Благодаря развитию методов машинного обучения в последние два года в области инженерии белков происходит настоящая революция. Если ранее практически любой проект требовал экспериментальной проверки большого количества тестовых образцов (зачастую нескольких тысяч и больше), то сейчас стали доступны новые методы, которые позволяют создавать новые белки с улучшенными свойствами гораздо быстрее (и дешевле)», — поделился руководитель исследования Иван Гущин, заведующий лабораторией структурного анализа и инжиниринга мембранных систем МФТИ.
Однако до недавнего времени белковая инженерия плохо справлялась с созданием молекул, которые связывают небольшие соединения небелковой природы. Это, например, кофакторы, которые не состоят из аминокислот и относятся к различным группам химических веществ.
Вероятно, вскоре в распоряжении ученых окажутся новые методы, предназначенные специально для таких «сложных» белков. Однако авторы новой статьи решили этого не дожидаться и попробовали поменять связывающие кофакторы белки с помощью метода, предназначенного для «обыкновенных». Такой прямолинейный подход не гарантировал успеха, ведь мутации даже на значительном расстоянии вполне могли «сломать» белки — нарушить их функции.
Объектом исследования стал белок CagFbFP, связывающий флавины — небольшие молекулы, необходимые для множества биологических реакций. Коллектив из МФТИ не впервые использует эту биомолекулу, исходно выделенную из растущей при высокой температуре бактерии Chloroflexus aggregans. Недавно ученым удалось внести мутации в последовательность CagFbFP, изменив спектры его флуоресценции, и установить механизмы такого «перекрашивания».
Биофизики учли, что мутации в расположенной вблизи кофактора части белка могут нарушить связывание молекул, флуоресценцию их комплекса и его стабильность. Поэтому они меняли только ту часть белка, которая отдалена от связывающего лиганд «кармана». Нейронные сети предложили заменить в общей сложности более половины (до 55–66%) аминокислот CagFbFP. Замены оказались довольно специфичными: они повлияли на распределение заряда на поверхности белка и склонность его молекул объединяться в пары (димеры). Тем не менее мутации не помешали новым флавинсвязывающим белкам сохранить ценные свойства. Авторы убедились в этом, синтезировав реальные белковые молекулы и изучив их физические свойства.
«Мы получили замечательный результат: из трех предсказанных искусственных конструкций, несмотря на большое количество изменений, все три оказались функциональны. Более того, одна значительно превзошла по свойствам исходный белок. Сейчас мы занимаемся проверкой применимости этого подхода к более сложным случаям, в том числе к используемым на практике ферментам», — отметил Иван Гущин.
Стоит отметить, что остроумный подход ученых использован впервые в мире. Однако параллельно работавшие над ним исследователи из MIT (Массачусетского технологического института, США), которые использовали другие белки, смогли опубликовать аналогичные результаты раньше. Хотя, если учесть время появления первых версий статей (препринтов) и подачу их в журналы, то первенство следует отдать именно команде из МФТИ.
Работа поддержана Российским научным фондом (грант 21-64-00018).
4
